乳腺癌是全世界最常见的一种女性恶性肿瘤。三阴性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达均为阴性的乳腺癌，约占所有乳腺癌病理类型的15%～20%。本研究发现，一种经雌激素诱导的名为RING finger protein 208 （RNF208）的E3连接酶蛋白，可以经泛素化直接降解波形蛋白，从而抑制TNBC细胞的转移。
波形蛋白是一种中间丝蛋白，在侵袭性上皮癌中高度表达，包括乳腺癌，前列腺癌，胃癌，恶性黑色素瘤和肺癌，其表达水平与转移风险增加有关。波形蛋白的异常表达仅限于乳腺癌细胞中的TNBC细胞，加剧了乳腺癌细胞的侵袭。
RNF208在TNBC中显著低于管腔型，并且RNF208的低表达与不良的临床结果密切相关。RNF208的过表达抑制TNBC细胞的肿瘤形成和肺转移。从机制上讲，RNF208通过与磷酸化的波形蛋白的Ser39残基相互作用，促进波形蛋白蛋白酶体降解，从而抑制TNBC细胞的肿瘤形成和转移。
RNF208过表达减少肿瘤生长和肺转移—实验验证
验证RNF208在乳腺癌症进展中的生理功能
1、首先在体外和体内研究RNF208的表达水平是否影响肿瘤的发生。结果表明RNF208过表达显著降低了TNBC细胞的增殖（图1）。
图1 RNF208过表达Hs578T和MDA-MB-231细胞的倍增曲线
2、为了进一步测试RNF208对体内TNBC细胞致瘤能力的影响，将RNF208-tolu TNBC细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠。RNF208的过表达显著减小了TNBC细胞的肿瘤体积（图2）。
图2 将过表达TNBC的细胞经皮下注射到NOD/SCID小鼠（每组n=6），8周后处死（Hs578和MDA-MB-231），肿瘤大小（上）和肿瘤体积（下）
使用无异源可注射的VitroGel水凝胶VHM01 /TWG003包裹TNBC细胞进行移植。分别比较转染空载体(LPCX)（对照组），转染RNF208过表达载体（实验组）的Hs578T和MDA-MB-231两种细胞。在本次小鼠植瘤实验中，与对照组相比，过表达RNF208组中的波形蛋白表达水平降低，肿瘤生长明显受到抑制。
3、此外，细胞增殖标志物Ki-67的表达降低，而细胞死亡标志物caspase-3在RNF208过表达的原发性肿瘤组织中与对照组织相比增加（图3）。
图3 原发性肿瘤组织中表达Ki67和RNF208 IHC图像（上），细胞死亡标志物caspase-3表达对比（下）
成瘤能力检测试验
将TNBC细胞注射到6周龄NOD/SCID小鼠（每组n=5）。以转移到肺为标志，比较对照组和细胞受RNF208保护的实验组的转移潜能。VitroGel 水凝胶在室温条件下十分稳定，可直接与细胞悬液混合，在与细胞混合后数小时内仍然维持可注射的状态。研究者还可以通过直接向细胞悬液中加入各种添加物，完全掌控培养体系中的营养成分。本研究将TNBC细胞重悬于1:3 PBS/VitroGel RGD水凝胶溶液中，皮下注射到小鼠体内，测量肿瘤生长（图4）。
图4 对照组和注射NF208过表达MDA-MB-231-Luc的NOD/SCID小鼠（每组n=5）6至8周肺部的生物发光图像（左图），India ink染色肺组织显示转移性结节（右上图），散点图显示无转移性结节的数量（右下图）
结果显示，在实验组RNF208过表达组中，TNBC细胞迁移和侵袭能力显著降低。本研究结果表明RNF208的表达水平与波形蛋白介导的乳腺癌细胞侵袭性癌症进展密切相关。
体内肿瘤形成和肺转移实验
实验动物：NOD/ShiLtJ-Rag2em1AMC Il2rgem1AMC 小鼠
细胞系：Hs578T、MDA-MB-231
细胞外基质：水凝胶VitroGel（货号：VHM01 /TWG003）
检测内容：测量肿瘤大小
研究周期：4-8周
体内肿瘤形成实验：
1)将1×107逆转录病毒感染的Hs578T和MDA-MB-231细胞重悬于1:3 PBS/水凝胶(TheWell Bioscience)溶液中。
2)皮下注射至6周龄雌性NOD/ShiLtJ-Rag2em1AMC Il2rgem1AMC 小鼠（n = 6只/组）中。
3)注射后第4周开始每周监测肿瘤大小，用公式V=(A×B2)/2计算肿瘤体积，其中V为体积(mm3)，A为长径(mm)，B为短径(mm)。
肺转移实验：
1)1×106 逆转录病毒感染的MDA-MB-231-Luc细胞通过尾静脉注射至雌性NOD/SCID小鼠体内。
2)注射后4周开始每周监测肺转移的发生情况，采用IVS-200系统(Xenogen Corp)检测生物发光信号。
3)对肺组织进行染色，计数结节并进行分析。肿瘤组织用10%福尔马林溶液固定，石蜡块包埋。用相应抗体染色，进行免疫组化实验。
VitroGel水凝胶拥有成分明确、室温下操作、良好的流变性等特点，已经成功应用于多种细胞系的成瘤研究，拥有较高的肿瘤形成效率。
图5 VitroGel水凝胶应用于动物成瘤案例
参考文献：
Pang, K., Park, J., Ahn, S.G. et al. RNF208, an estrogen-inducible E3 ligase, targets soluble Vimentin to suppress metastasis in triple-negative breast cancers. Nat Commun 10, 5805 (2019). https://doi.org/10.1038/s41467-019-13852-5
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